cas9為什麼沒切割效果

⑴ 為什麼 cas9 編輯 分裂細胞 同源重組

基因敲除（geneknockout），是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然後從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。這與早期生理學研究中常用的切除部分-觀察整體-推測功能的三部曲思想相似。
基因敲除除可中止某一基因的表達外，還包括引入新基因及引入定點突變。既可以是用突變基因或其它基因敲除相應的正常基因，也可以用正常基因敲除相應的突變基因。 基因敲除是80年代後半期應用DNA同源重組原理發展起來的一門新技術。80年代初，胚胎幹細胞（ES細胞）分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。此後的幾年中，基因敲除技術得到了進一步的發展和完善。
基因敲除的技術路線如下：
（1）構建重組基因載體﹔
（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉入受體細胞核內﹔
（3）用選擇培養基篩選已擊中的細胞﹔
（4）將擊中細胞轉入胚胎使其生長成為轉基因動物，對轉基因動物進行形態觀察及分子生物學檢測。

⑵ crispr/cas9技術敲除大片段只能切割雙鏈嗎

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⑶ crispr/cas9的原理

此系統的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過鹼基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而通過人工設計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。
作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶是已知的第一個統一因子（unifying factor），能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，並表達適當的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可連接到目標DNA，不影響 Cas9 的結合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列處帶來任何融合蛋白及 RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。

⑷ 有人用CRISPR/Cas9系統做細胞基因敲除嗎交流下

是的，確切來說是大量表達。 大腸桿菌是基因重組技術中常用的細菌，將外源目的基版因權(如人胰島素基因)導入大腸桿菌後可在大腸桿菌內表達目的蛋白(如胰島素)，由於細菌繁殖速度快，通過發酵便可在短時間內獲得大量胰島素，再經多步分離、純化便得到了葯用胰島素。

⑸ 什麼是crispr/cas9脫靶效應

什麼是來CRISPR/Cas9？ CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 是在細菌和古自細菌中廣泛存在的成簇的、有規律的、間隔的短迴文重復序列。 07年，發現細菌可以用CRISPR系統抵抗噬菌體的入侵；08年，發現細菌的 CRIS

⑹ 基因編輯是什麼東西

就是可以匹配出自己想要的高端下一代

⑺ crispr/cas9到底是什麼東西大家有關於這個的介紹和資料嗎

最近幾年基因編輯技術異常火爆，CRISPR/Cas9技術面世以後，彌補了傳統基因編輯技術的諸多不足，使得基因的「任意編輯」變得越來越容易。也因此，CRISPR/Cas9技術當仁不讓的成為基因編輯技術的「王牌」，大有一副取而代之的勢頭。所以這里就給大家簡單介紹一下CRISPR/Cas9的技術原理！
一、CRISPR/Cas9系統的構成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。目前，來自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系統應用最為廣泛。
Cas9蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然後通過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
研究人員為了將CRISPR/Cas9技術發展為高效的基因打靶工具，又進行了優化和改造。Cong, L.等人[1]在不影響系統效率的情況下，將crRNA和tracrRNA融合為一條RNA。通過這種簡化，CRISPR/Cas9系統現僅包括兩個元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此現在人們將CRISPR/Cas9技術也稱為Cas9/sgRNA技術。
二、CRISPR/Cas9技術的基因編輯機制
CRISPR/Cas9通過對預設的DNA位點進行切割，造成DNA雙鏈斷裂（DSB, double strand break）。這種DNA的損傷可以啟動細胞內的修復機制，主要包括兩種途徑：
一是低保真性的非同源末端連接途徑（NHEJ，Non-homologous end joining），此修復機制非常容易發生錯誤，導致修復後發生鹼基的缺失或插入（Indel），從而造成移碼突變，最終達到基因敲除的目的。NHEJ是細胞內主要的DNA斷裂損傷修復機制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的實現移碼突變，從而制備基因敲除模式動物。CRISPR/Cas9技術的出現，使得無需再使用相應物種的ES細胞系就可以制備基因敲除模式生物，且已成功應用於小鼠[5]、大鼠[6]、豬[7]、靈長類[8]、果蠅[9]等等。
第二種DNA斷裂修復途徑為同源介導的修復（HR, homology-directedrepair），這種基於同源重組的修復機制保真性高，但是發生概率低。在提供外源修復模板的情況下，靶向核酸酶對DNA的切割可以將同源重組發生的概率提高約1000倍[10]。利用這種機制可以實現基因組的精確編輯，如：條件性基因敲除、基因敲進、基因替換、點突變等等。
CRISPR/Cas9技術以自己操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，成為當下科研工作者的新寵兒。各大實驗室紛紛加入開發CARISPR/Cas9技術的行列中，媒體也將之評為21世紀最有影響的十大技術之一。讓我們跟隨CRISPR/Cas9技術的腳步一起加強科研基礎的建設，推動生物科研的進步！

詳細信息你可以參考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html

⑻ 怎樣防止cas9切割質粒dna

3)將離心管放來入煮沸的水浴中自，時間恰為40秒。8)小心吸去上清液，將離心管倒置於一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附於管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，並用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉澱，然後繼續用吸頭通過抽真空除去附於管的液滴。如果小量制備的DNA不被限制酶切開，很有可能在收獲細菌的步驟3)或上述步驟8)未能很好地去除所有液體。這種情況下，可用酚:氯仿抽提DNA終產物，然後用乙醇重新沉澱DNA，通常，用5-10倍過量的酶(特別是並不昂貴的酶)在100-200μl 體積中進行消化，可以克服限制酶切割反應遇到切割反應遇到的困難。消化後， 加0. 1 體積3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2倍體積乙醇沉澱DNA。

⑼ 如何驗證crisper cas9效果

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件[1]。

目前，來自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA 兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然後通過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。

由於PAM序列結構簡單（5』-NGG-3』），幾乎可以在所有的基因中找 到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用於植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統[1]。

通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通過普通質粒,質粒構建流程如下：

Cas9質粒構建

目前常見的CAS9普通質粒有（漢恆生物提供cas9質粒試劑盒）：

雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現解決了質粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質粒見addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩定的表達（漢恆生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包裝），但是由於慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大於4kb），且長期插入可能導致亂切，脫靶等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優勢，腺病毒克隆能力強，獲得的病毒滴度也高。同時相對於普通質粒來說，作用是時間也比較長，可以達到更理想的敲除效果。